大鼠淋巴血管內皮細胞提取物

冷凍保存細胞之方法:
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

大鼠淋巴血管內皮細胞提取物是從大鼠原代淋巴血管內皮細胞提取的，大鼠原代淋巴血管內皮細胞從正常大鼠淋巴組織制備。所有的產品在發貨之前均經過嚴格的QA/QC流程以確保其質量。這些產品可以直接用于基因克隆，表達圖譜分析以及各種分子生物學實驗的研究。
總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結果等。

cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA鏈，以50ul總反應體系進行逆轉錄，體系中包括MMLV反轉錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應10min 后終止RT反應。利用1x RT Buffer 運輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應。所有cDNA產品在訂單發貨之前都經過了嚴格的QA/QC分析，保證了產品的質量。

蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備大鼠淋巴血管內皮組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

潛在的應用： <1>已知基因的PCR克??；<2>mRNA選擇性剪接；<3>基因克隆與目標測序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白檢測與蛋白質組學；<6>芯片研究與表達圖譜。

細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數換液方式，棄去半數培養基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。懸浮細胞凍存時，應將細胞收集，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，少量保存上清液（防止細胞吸走），加入部分新鮮培養基，吹打均勻后，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO搖勻后進行凍存。凍存培養基
凍存細胞時必須使用推薦的凍存培養基。凍存培養基中應含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。還可使用專門配制的*凍存培養基。
1）細胞凍存培養基是一種用于哺乳動物細胞的即用型*凍存培養基，其所含胎牛血清和牛血清比例經過優化，可改善細胞活力以及解凍后的細胞復蘇效果。 
2）凍存培養基是一種化學成分確定的、無蛋白、無菌凍存培養基，含10% DMSO，適用于多種干細胞和原代細胞 (黑色素細胞除外) 的凍存。
操作流程：
1.1主要試劑與儀器：倒置相差顯微鏡（日本 olympus imt-413），co2孵箱（日本yamato it-61）。
1.2 hek-293細胞的復蘇培養傳代及凍存：
1.2.1 細胞的復蘇培養 從液氮罐中取出凍存管,立即投入37℃水浴,并不斷的搖動,使之迅速融化。 將溶解的細胞凍存管取出,用酒精消毒后打開,吸出溶有細胞的凍存液,加入事先裝好培養液（37℃預熱，8～10倍體積）離心管內,稍微吹打混勻,然后1000rpm 5min,去除上清,加入適量培養液,吹打成細胞懸液, 以1×105/ml密度接種于25cm2培養瓶內，在37℃、5％co2及飽和濕度下培養。
1.2.2 細胞傳代 原代培養的hek－293細胞48h換液1次，細胞長至60%～70%融合時，用0.25%胰酶消化1～2min，將培養瓶再用手掌輕輕敲打使細胞脫壁、懸浮、分散，為使細胞進一步分散可用吹打管輕輕吹打幾次，獲得細胞懸液，然后加入倍量的培養基，溫和混勻，吸管分裝混合液，傳代擴增細胞。
1.3 細胞形態的觀察 在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞的生長情況及形態特征。
1.4 細胞的計數 常規消化細胞，待細胞變圓、脫壁并浮起，加入少量培養基離心，再用pbs重懸并吹打制成細胞懸液。在細胞計數板蓋玻片的一側加微量細胞懸液，用10×物鏡觀察計數板四角大方格細胞數，按公式計算出細胞數。細胞數/ml原液＝(四方格細胞數之和/4) ×104。
1.5 細胞的貼壁率 指數生長期的細胞，以0.25％胰酶消化成單細胞懸液，計數后分別接種于12個25cm2培養瓶中，每兩小時隨機取出3瓶細胞，吸除培養基及未貼壁細胞，加入胰消化酶消化、計數已貼壁細胞，取其平均值，按照公式：貼壁率(%)=(已貼壁細胞數/接種細胞數) ×100％，計算貼壁率。 
1.6 生長曲線 取指數生長期的細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，以1×104/孔接種于24孔板，每孔加入1ml培養基。每天隨機取3孔，計數每孔細胞的數目并計算平均值。連續計數10d，繪制細胞生長曲線。

以下是的相關產品：

9.375pg/mlPolymyxin B Sulfate 多粘菌素B人精氨酶1(Arginase-1)ELISA試盒

18.75pg/mlPuromycin 嘌呤  ACROS人ALK酪氨激酶受體ELISA試盒

46.875pg/mlPuromycin 嘌呤  ACROS人小扁豆素結合型胎蛋白/胎蛋白質體3(AFP-L3)ELISA試盒

0.188ng/mlPuromycin 嘌呤  ACROS人輔肌動蛋白α3(ACTN3)ELISA試盒

0.469ng/mlRapamycin 雷帕 人腎素受體(Renin receptor)ELISA試盒

23.438pg/mlRapamycin 雷帕 人腺苷脫氨酶域包含蛋白1(ADAD1)ELISA試盒

18.75pg/mlRoxithromycin 羅紅人伯胺氧化酶膜(Membrane primary amine oxidase)ELISA試盒

4.688pg/mlSpectinomycin 鹽壯觀人組織非特性性酶(AP-TNAP)ELISA試盒

9.375pg/mlSpectinomycin 鹽壯觀人多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)ELISA試盒

0.094ng/mlSpiramycin 螺旋人糖蛋白α1B(A1BG)ELISA試盒
大鼠淋巴血管內皮細胞提取物胰腺再生蛋白Iα(REG1α)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)間基苯;間苯

抑瘤素M受體(OSMR)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)5--4-氯-3吲哚神經氨鈉鹽

抑制素βB(INHβB)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)ABEI；N-（4-氨基）-N-基魯米諾

細胞色素b-561(CYB561)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)TTAC；十四基三基氯化銨

主要穹窿蛋白(MVP)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)DTAC；十二基三基氯化銨

鈣腔蛋白(CALU)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)十四基三基化銨(TTAB)

淀粉酶α(Amyα)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)十二基三基化銨

白介素2受體α(IL2Rα)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)CTAB；十六基三基化銨

蕈型膽受體M3(CHRM3)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)CTAC;十六基三基氯化銨

小乳腺表皮粘蛋白(SBEM)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)十八基三基氯化銨

去氨精氨加壓素(DDAVP)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)STAB；十八基三基化銨

Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PⅠNP)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)十基三基化銨

半胱氨酰白三烯受體2(CYSLTR2)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)EHDAB；十六基二基基化銨

絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶5(MAP4K5)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)十二基二基基化銨

樁蛋白(Pax)檢測試盒(酶聯免疫吸附試驗法)十四基二基芐基氯化銨

實驗報告：
一、分離與培養：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將組織剪成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；
5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。