人抗線粒體抗體ELISA試劑盒

人抗線粒體抗體英文名稱：AMA ELISA Kit產品別名：人AMA elisa試劑盒用于測定血清，血漿及相關液體等樣本。例如適合檢測包括血清、血漿、尿液、胸腹水、灌洗液、腦脊液、細胞培養上清、組織勻漿等標本。

試劑配制：

1、酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔或者48孔）。
2、標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3、樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4、生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5、辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6、生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7、辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8、底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9、濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10、終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
樣本處理及要求：
1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過一夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.  細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注意事項：

1.使用前請保存在2-8℃。復溶后的標準品若未用完，請廢棄。
2. 微量試劑運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請1000轉/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正?，F象，微加熱至40℃使結晶*溶解后再配制洗滌液。
（加熱溫度不要超過50℃）使用時洗滌液應為室溫。
4. 不同批號的試劑盒組份避免混用（洗滌液和反應終止液除外）。
5. 充分輕微混勻對反應結果尤為重要，使用微量振蕩器，如無微量振蕩器，可在反應孵育前手工輕輕混勻。
6. 在試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。
7. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用！否則將影響試驗結果。
8. 試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時，請按國家生物試驗室安全防護條列執行。
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操作流程：
（1）待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl，每種樣品設3個平行孔；設兩個陰性對照孔，每孔加未處理組的細胞裂解液100μl；另設一個空白對照孔，加入純細胞裂解液100μl。 
（2）酶標板置4℃，包被過夜。
（3）洗板：吸干孔內反應液，用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去），之后將洗滌液注滿板孔，浸泡1-2分鐘，間歇搖動。甩去孔內液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。
（4）陰性對照孔每孔加入PBS 50μl，樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。 
（5）酶標板置37℃培養箱的濕盒內，孵育60min。 
（6）洗板，同（4）。 
（7）每孔加1:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。 
（8）酶標板置37℃培養箱的濕盒內，孵育60min。 
（9）洗板，同（4）。 
（10）每孔加TMB顯色液 100μl，輕輕混勻10s，置37℃暗處反應15-20min。 
（11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。 
（12）分別測450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，終測得的OD值為兩者之差（W1-W2），以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
（13）數據處理：在得出標本（S）和陰性對照（N）的 OD值后，計算S/N值。S/N≥2.1為陽性判定標準。